一、樣品選擇

對樣品和蛋白質(zhì)靶標(biāo)的已有了解十分重要。選擇具有已知靶蛋白表達(dá)的系統(tǒng)將顯著增加Duolink® PLA實(shí)驗(yàn)成功的幾率。

Duolink® PLA實(shí)驗(yàn)所需的樣本與用于傳統(tǒng)免疫熒光 (IF)、免疫組織化學(xué) (IHC) 或流式細(xì)胞術(shù)的樣本相同。因此，Duolink® PLA試劑適用多種樣品類型，包括：

1.貼壁細(xì)胞

2.懸浮細(xì)胞

3.血細(xì)胞

4.細(xì)胞離心涂片制劑

5.石蠟包埋細(xì)胞樣品

6.石蠟包埋組織切片

7.冰凍組織切片

8.新鮮組織切片

在進(jìn)行 Duolink® PLA 實(shí)驗(yàn)之前，必須對所有樣品進(jìn)行固定。對于流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用，需要使用懸浮細(xì)胞。

選擇讀出方法：

Duolink® PLA產(chǎn)品提供了熒光和明場版本選擇。熒光 Duolink® PLA 試劑可用于顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用。

選擇讀出方法的關(guān)鍵考慮因素是專用設(shè)備的可用性。熒光顯微鏡是 Duolink® PLA 實(shí)驗(yàn)常用的讀出設(shè)備。上述所有樣品類型均可與熒光Duolink® PLA 試劑一起使用，不過，部分樣品會表現(xiàn)出明顯的自發(fā)熒光。如果發(fā)生這種情況或當(dāng)熒光儀器不可用時(shí)，可用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行明場Duolink® PLA實(shí)驗(yàn)。

流式細(xì)胞術(shù)方案對于儀器類型是不可知的（假設(shè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所需的合適濾光片可用），并且較易于適用于貼壁或懸浮細(xì)胞。

二、樣品處理

樣品應(yīng)在固定、透化和抗原修復(fù)方面進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚怼?shí)驗(yàn)中所用一抗的條件優(yōu)化對檢測性能至關(guān)重要。

固定：

固定過程用于固定抗原，同時(shí)保留細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。固定劑的選擇可根據(jù)樣品類型（細(xì)胞或組織）、一抗和蛋白靶標(biāo)的不同而不同。不同的固定劑可影響一抗的抗原性，從而影響一抗的性能。如果所選一抗沒有推薦固定方法，則必須由用戶進(jìn)行優(yōu)化。

Duolink® PLA試劑與 IF 和 IHC 的所有常用固定劑兼容，包括：

1.丙酮

2.乙醇

3.甲醛

4.甲醇

5.多聚甲醛

6.鋅

透化：

抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)表位需要透化作用。這通常是通過 Triton X-100、NP-40、Tween-20 或 digitonin等去垢劑來實(shí)現(xiàn)。有許多去垢劑可供選擇——使用一種適合固定和所用樣品的去垢劑。值得注意的是，一些固定劑（如丙酮和甲醇）也會引起透化，因此可能不需要額外的透化步驟。

抗原修復(fù)：

抗原修復(fù)用于顯示在固定過程中被掩蓋的抗原表位，從而允許抗體結(jié)合。抗原修復(fù)常用于福爾馬林固定的石蠟包埋 (FFPE) 樣品，但有時(shí)也用于懸浮固定的細(xì)胞。不同的抗原修復(fù)方法可能影響一抗的性能，因此必須由用戶進(jìn)行優(yōu)化。

兩種主要方法是熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)法 (HIER) 和酶誘導(dǎo)抗原修復(fù)法 (PIER)。Duolink® PLA 與 IHC 的常用抗原修復(fù)緩沖液兼容，包括：

HIER：Trilogy™、檸檬酸鹽、EDTA 和高 pH Tris

PIER：用蛋白酶 K、胃蛋白酶和胰蛋白酶處理