高質量的組織制備對于高質量的免疫組織化學結果絕對必要，因此始終值得花時間確保按照盡可能高的標準進行，以避免令人失望的結果。根據實驗要求，組織可能需要新鮮使用或固定。

1 冷凍組織以供后續(xù)處理

有時需要在進一步處理或隨后的固定之前冷凍組織。如果冷凍不當，可能會形成冰晶，損害細胞結構。通過正確冷凍，這將保持組織的質量，從而最大限度地提高免疫染色成功的機會。

1. 將裝有異戊烷的燒杯（長燒杯中至少 500ml）在 -80°C 中或使用干冰預冷至 -42°C 至 -45°C 之間。定期監(jiān)測溫度以確保溫度保持在這個范圍內。

2. 在冰上使用干凈的工具解剖組織。

3. 將紙巾放在鋁箔上，并用濾紙除去多余的液體。

4. 將組織（不含鋁箔）輕輕浸入異戊烷中。冷凍所需時間取決于組織樣本大小，但冷凍成年大鼠大腦大約需要 5 分鐘。

5. 在從異戊烷中取出組織之前，預冷鑷子。將冷凍組織放入裝有軟紙巾的預冷管中。

6. 儲存于-80°C 直至下次使用。

2 灌注固定

一般來說，當動物被灌注固定時，可以獲得最佳質量的組織切片。該過程涉及先用緩沖液然后用固定劑替換血液，并且其具有高自發(fā)熒光。在嘗試之前，請確保您的監(jiān)管制度涵蓋了這一點，并獲得經驗豐富的從業(yè)人員的培訓。針對嚙齒類動物的一般方案是：

1. 通過適當途徑過量注射麻醉劑，直至動物沒有腳趾捏和眨眼反射但心臟仍在跳動。

2. 打開胸腔，露出心臟，剪斷右心房。將針插入左心室，并通過冰冷的 PBS（大鼠約 200ml，小鼠約 15ml）灌注，然后灌注類似體積的 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液。

3. 取出大腦/其他器官，放入裝有 4% 多聚甲醛的小瓶中，在 4°C 下放置 24 小時。

4. 將組織移入 4°C 含 30% 蔗糖的 PBS 中，直至組織沉入小瓶底部

3 浸入固定

對于小體積的組織，通常用固定劑孵育組織就足夠了，而不是使用灌注固定。然而，這將導致較高的背景，因為血液不會從小毛細血管中去除。

1. 在冰上用干凈的工具解剖組織。

2. 用冰冷的 PBS 短暫清洗

3. 將組織放入含 4% 多聚甲醛的 PBS 中，4°C 下放置 24 小時

4. 將組織移入 4°C 含 30% 蔗糖的 PBS 中，直至組織沉入小瓶底部

4 切片

可以在一系列機器上切割切片，最常見的是低溫恒溫器和冷凍切片機。機器的選擇部分取決于可用性，部分取決于需要切割多厚的部分。檢查可用機器的規(guī)格是否與所需的截面厚度相匹配。

對于載玻片免疫組織化學，切片可以直接切割到顯微鏡載玻片上，或者切割到 PBS 中，用于自由浮動免疫組織化學。

切割后，切片可以冷凍以供日后處理：

• 載玻片安裝：讓切片干燥后，切片可在 -20°C 至 -80°C 下保存長達一年

• 自由浮動 將切片轉移至冷凍保護劑中，然后在 -20°C 下保存長達一年。